información del capítulo y del autor
Autor
-
José Maurício Schneedorf
* Dirija toda la correo a:
DOI: 10.5772 / 50053
Desde lo editado Volumen
IntechOpen Probiótico en animales Editado por Everlon Rigobelo
Probiótico en animales
19459043] Editado por Everlon Cid Rigobelo
Exhibir +
[19459 047]
1. Introducción
Los prebióticos son moléculas no digeribles producidas por microorganismos probióticos [ 1 ]. Los microorganismos probióticos son por lo general bacterias u hongos reconocidos como seguros, con sus caracteristicas fundamentadas en la producción de ácidos orgánicos, reducción de aminas biogénicas, digestión / descomposición de hidratos de carbono y proteínas, respuestas inmunomoduladoras y antiinflamatorias, reducción de aminas cancerígenas y producción de péptidos antimicrobianos, etc [ 2 ]. Hoy en día, los probióticos se consumen primordialmente como yogures probióticos y otros productos lácteos probióticos, suplementos dietéticos, formas espumosas y bebidas cultivadas con probióticos para el empaquetado de dosis cotidianas, etc. También se asegura que los prebióticos mejoran el confort a través de ocupaciones inmunomoduladoras y metabólicas, y actúan como una barrera natural contra los procesos patológicos [ 1 ]. Se cree que estas moléculas son un propósito para la producción y la salud humana y animal, y representan un mercado multimillonario de comestibles funcionales. Además, el creciente mercado de prebióticos cuenta hoy con una cantidad enorme de inventos patentados, relacionados con el aislamiento, la producción, la preparación, los métodos de uso o la aplicación de novedosas moléculas que mejoran la salud. La producción y el consumo global de comestibles funcionales es una industria que mueve millones, con un tamaño de mercado estimado de cerca de US $ 60 mil millones en 2008-9, numerosas ocasiones más grande que los costos de régimen de salud solo en los EE. UU. $ 832 millones ( Figura 1) . En forma de comparación, el mercado global de productos probióticos fue de US $ 15.9 mil millones en 2008 y de US $ 19 mil millones en 2009, con una tasa de desarrollo anual compuesta (CAGR) del 11.7% (2009-2014). Además, el mercado de probióticos sosprechado para 2014 para Europa y Asia comprende, respectivamente, US $ 12.9 mil millones (11.1% CAGR) y US $ 8.7 mil millones. Japón, un líder mundial de comestibles funcionales, dedicó US $ 4.5 mil millones al estudio y comercialización de prebióticos, con US $ 1.5 mil millones premeditados de forma exclusiva al comercio de oligosacáridos en 2009 [ 3 ]. Los EE. UU. Han ocupado la segunda posición en la última década, con una comercialización de US $ 110 millones para oligosacáridos funcionales (35% de inulina, 20% de oligosacáridos de manano y 10% de fructano), y con una tasa de CAGR del 20%. Se proyecta que el mercado estadounidense de prebióticos alcance US $ 1.2 mil millones y US $ 225 millones, respectivamente, para el año 2015 [ 3 ]. Esto alcanzó US $ 21.6 mil millones en 2010 y se estima que alcance los US $ 31.1 mil millones en 2015, y una tasa compuesta anual de 7.6% para el período de 5 años.
Figura 1.
Mercado global de prebióticos de 2008 a 2010 [3].
2. Estudios sobre el kéfir de agua
Generalmente, los prebióticos se piensan oligosacáridos no digeribles pero fermentables, comprometidos en la promoción de la salud del huésped [[ 19459061] 4 ]. Se conoce que estos compuestos ofrecen novedades en el estado sobre nutrición, además de provecho complementarios para la salud, como protección contra la carcinogénesis, mutagénesis, prevención de lesiones ocasionadas por radicales libres, control de la flora intestinal, resistencia gastrointestinal, disminución de la presión arterial inducida por hipertensión, producción de [ 19459062] β -interferón, cortisol y noradrenalina, incremento de la actividad fagocítica de los macrófagos pulmonares y peritoneales, incremento de las células IgA en estos sitios, actividad antimicrobiana y actividad antiinflamatoria, etc [ 1 ] El kéfir, una fermentación ácido-alcohólica que se consume comunmente en Europa del Este como suspensiones lechosas gracias a sus provecho potenciales para la salud [ 5 ], es con la capacidad de producir prebióticos de péptidos y azúcar (p. Ej., Lactacina, bactericinas, KGF, kefiran) [ 1 ].
Históricamente, los granos de kéfir ( Figura 2) se consideraban un obsequio de Alá entre los musulmanes de las montañas del norte del Cáucaso [ 6 ]. La palabra kéfir se proviene de la palabra turca keif , que puede traducirse en un óptimo sentimiento para el sentido experimentado después de beberlo, o sus declaraciones de salud promovidas. Los granos de kéfir se pasaron de generación en generación entre las tribus del Cáucaso, considerándose una fuente de riqueza familiar [ 6 ]. Los granos de kéfir también se tienen la posibilidad de cultivar en una solución de azúcar y agua cruda (por ejemplo, melaza), popular como kéfir azucarado, agua o agua. Los granos de kéfir azucarados son muy semejantes a los granos de kéfir de leche en términos de su composición, microorganismos asociados y productos formados a lo largo de el desarrollo de fermentación, aunque sin el aspecto característico de la coliflor. El kéfir de agua, el kéfir azucarado o el kéfir de agua, por lo general es una bebida fermentada casera fundamentada en una solución de sacarosa con o sin extractos de frutas. El kéfir radica en granos gelatinosos e irregulares formados por un consorcio de levaduras y bacterias de ácido láctico incrustadas en una matriz de polisacárido fuerte llamada kefiran [ 7 ]. Desde 2002, nuestro grupo de investigación se ha destinado a estudiar las caracteristicas y los efectos beneficiosos de los extractos de kéfir y kefiran [ 7 , 8 ] y, más hace poco, un oligosacárido aislado de la fermentación de kéfir de agua, y llamado kéfir carbohidrato acuoso (AK) [ 9 ].
Figura 2.
Exhibe de granos de kéfir de agua después de agriar una solución de melaza.
A distingue del polisacárido kefiran encapsulado en bacterias lechosas, AK se ve ser un oligosacárido aislado de una fracción acuosa de granos de kéfir [ 10 ].
2.1. Características del kéfir
2.1.1. Cepas microbianas
Se han reconocido diferentes conjuntos de levaduras y bacterias en el kéfir de agua de numerosas zonas y fuentes, y con métodos tanto dependientes de cultivo como moleculares. Sin embargo, el kéfir puede cambiar su relación bacteriana / levadura, inclusive sus cepas microbianas en función del tiempo, las condiciones experimentales, la temperatura y los microorganismos vecinos, en el grano de adentro [ 11 ]. Un consorcio típico se ve radicar primordialmente de bacterias de ácido láctico más levaduras que promueven la fermentación alcohólica, adjuntado con algunas bacterias de ácido acético ( Tabla 1) , probablemente oxidando el etanol formado [ 12 ]. Más allá de la enorme diversidad microbiana que está en las muestras de kéfir de varias zonas, hay cepas recurrentes que prevalecen en las fuentes de kéfir de diferentes países. Las cepas más probables encontradas en el kéfir son Lactobacillus , Leuconostoc , Kluyveromyces y Acetobacter género, aunque el ‘organismo’ simbiótico también había anunciado algunos microorganismos extraños, como Chryseomonas y Kloekera [ 13 ].
Tabla 1 Tabla 1 1 .
Algunas cepas microbianas encontradas en muestras de kéfir de agua [ 13 , 14 ].
2.1.2. Crecimiento
Numerosos autores han estudiado los cambios en los parámetros físicos, químicos y microbiológicos a lo largo de los cultivos continuos de kéfir de agua desde los años 50 [ 15 ]. En nuestro laboratorio, se analizaron muestras de granos cultivados en resoluciones de melaza de 50 a 200 g L -1 en agua destilada para muchos parámetros, como temperatura óptima y pH de avance, fuerza iónica, algunos metabolitos (glucosa y glicerol ), el desarrollo cambia después de la congelación, inclusive a -70 ° C, y las proporciones de bacterias / levaduras. Los resultados enseñaron una temperatura máxima de desarrollo de precisamente 25 ° C, y una disminución continua del pH para las suspensiones hasta 20 h (de pH 6.1 a pH 4.5). En tanto que las suspensiones de kéfir presentaron escenarios decrecientes de glucosa (7 veces), el glicerol aumentó 3 ocasiones a lo largo de el cultivo en melaza en condiciones fisiológicas a lo largo de 7 días. El cociente de bacterias / levaduras del kéfir de agua mostró una prevalencia de bacterias de ácido láctico en los granos (31 ± 8% mayor), en tanto que las levaduras se han encontrado primordialmente en las suspensiones (63 ± 6% mayor). Increíblemente, los granos de kéfir de agua demostraron una más grande resistencia contra propiedades del ambiente extremas. Como ejemplo, los granos lograron crecer en KCl hasta un 5%, o inclusive a temperaturas inferiores a 4 ° C. En las condiciones de desarrollo de los hogares, las curvas de biomasa de los granos guardados congelados enseñaron una inclinación lineal continua hasta el 5 th mes de alojamiento de granos, y con una tasa de descomposición de 4 g / día /mes. No obstante, se ha reconocido una interrupción progresiva del metabolismo general de los granos autoorganizados bajo congelación a -70 ° C. Para evaluar esta resistencia enormemente aparente de los granos de kéfir, hemos llevado a cabo algunos desafíos contra los antibióticos, la irradiación y los tratamientos con gases, con kéfir de agua.
2.1.3. Resistencia
Como granos gelatinosos bien estructurados con distintas cepas microbianas en su composición, se planteó la hipótesis de que las bacterias y levaduras presentes en el kéfir podrían protegerse dentro de la matriz de polisacáridos, exhibiendo una resistencia diferente bajo tensiones físicas y químicas que se cuela libremente en la solución. Teniendo esto presente, se probó la resistencia de la colonia del kéfir contra tres causantes de desorden: exposición a la radiación ultravioleta (UV), administración de antibióticos y régimen de gases (oxígeno y ozono) [ 16 ]. Después de una etapa de desarrollo exponencial, las muestras fueron sometidas a UV y tratamientos químicos. Se tomó todos los días UV lejano (15 W D 2 ) en tubos que contenían los granos a lo largo de 5, 10, 30 y 60 min, hasta 9 días. El desarrollo de los granos se siguió gravimétricamente después de cortar los granos secos en seis capas, desde el núcleo de adentro hasta la cubierta externa de los granos. El régimen antibiótico se realizó con 1 ml de penicilina G (20 μ g L -1 ), 50 mg de nistatina (Fungizon) y 1 ml de estreptomicina (100 μ g mL -1 ) dispensado por separado en cultivos de kéfir a lo largo de 12 días a intervalos de 24 h. El régimen con gas se realizó con ozonización continua a 1, 5, 10, 30, 60 y 120 minutos en 0,5 g de granos de iniciación de kéfir, después del cultivo como se detalla. En todos estos desafíos, los granos lograron soportar condiciones extremas a lo largo de el cultivo. El régimen con UV, entre otras cosas, sugirió una recuperación relativa del desarrollo después del período de irradiación ( Figura 3) . Esto se reveló comparando las atentos de las curvas de desarrollo conseguidas antes de la irradiación UV (1.22 ± 0.15 g / día / g de muestra), después de 7 días de régimen (0.30 ± 0.02 g / día / g de muestra) y 15 días de régimen (0.56 ± 0,07 g / día / g de muestra). Con el régimen con antibióticos, se observó una disminución en las tasas de desarrollo 72 h después de la administración en medios de cultivo, con bacterias que aportan más biomasa a la composición del grano que las levaduras. Además, el régimen con gas resultó en una disminución exponencial de la tasa de desarrollo hasta 41 ± 23 (oxígeno) y 25 ± 8% (ozono) después de 7 días después de las exposiciones. Aunque estos causantes de caos lograron bajar el desarrollo del kéfir a lo largo de los desafíos, ninguno de ellos ha podido interrumpir completamente la composición del grano o la producción de biomasa después de las exposiciones. En conclusión, la vieja cultura del kéfir simbiótico mostró una fuerte resistencia contra los rayos UV, antibióticos y ozono, lo que permitió una recuperación cercana al desarrollo habitual después de las perturbaciones.
Figura 3.
Curvas de desarrollo de granos de kéfir sometidos a irradiación ultravioleta lejana hasta el noveno día, después del cultivo habitual con 1 g de exhibe de inicio.
2.1.4. Simbiogénesis artificial
La flora microbiana que se encuentra en los granos de kéfir fué estudiada desde el criterio de la red social simbiótica por Linn Margulis desde 1995 [ 17 ]. Consecuentemente, se aseguró [ 18 ] que los cultivos separados de granos de kéfir de microbios no crecen en la leche o tienen una actividad bioquímica reducida, lo que complica aún más el estudio de la población microbiana de granos de kéfir. No se sabe el mecanismo de simbiogénesis de los granos de kéfir de diferentes cepas de organismos unicelulares, aunque hay algunos datos sobre la recuperación de su composición y caracteristicas probióticas de la liofilización, y aún así, sobre la formación de un consorcio artificial producido por trozos de granos de kéfir. transferido a una solución de extracto de levadura-sacarosa [ 19 ]. Con un enfoque fácil, desarrollamos cultivos artificiales de kéfir atrapando sus cepas en perlas de alginato [ 20 ]. Para llevarlo a cabo, se cultivaron granos de kéfir en 200 g L -1 de solución de melaza a lo largo de 7 días. Después se recogió el sobrenadante, se centrifugó a 7000 rpm a lo largo de 15 minutos, se resuspendió en 5 ml de melaza como se indicó antes, y se filtró para evadir extractos de grano inferiores. Para la inmovilización celular, se mezclaron 100 ml de una solución de alginato de sodio al 4% con la suspensión de kéfir tratada y se vertieron en 1,5% de una solución fría de cloruro de calcio. Las cuentas de alginato-kéfir resultantes se cultivaron siempre con reemplazo de melaza a intervalos de 48 h. Increíblemente, los nuevos granos de kéfir habían surgido de la solución después de tres meses de cultivo ( Figura 4) , que se asemejan a los granos domésticos recurrentes, monitoreados por microscopía óptica a baja resolución, y con la propiedad de florecimiento común mostrada por la normalidad. granos ( Figura 5) .
Figura 4.
Cuentas frescas de alginato y kéfir (parte inferior de la imagen) y las cuentas cultivadas con medio de 48 h cambios por 96 días.
Figura 5.
Simbiogénesis de los granos de kéfir anclados a perlas de alginato de calcio y tratados con melaza para 3 meses. (a) división de grano, y (b) germinación de grano [20].
La actividad antimicrobiana se eligió como índice de comparación para los granos originarios y artificiales. Los ensayos se realizaron ingresando 0,1 ml (3 x 10 8 células) de S. aureus , S. tiphymurium , E. coli [19459063 ] y C. albicans en 1,5 ml de suspensiones de kéfir, después de la incubación a lo largo de 24 ha 35 ° C. Después de este período, se lavaron 0,1 ml de cada tubo en placas de Petri que contenían los medios de cultivo apropiados y se incubaron a lo largo de 24 y 48 h. Al contar los formadores de entidades de colonias (CUF) para los granos originarios y artificiales, la actividad antimicrobiana del kéfir exhibió un patrón semejante, con inhibición total para todas las cepas de los dos tipos de kéfir (producidos en forma nativa y artificial). La fotomicroscopía mostró un incremento en la formación de granos de granos de alginato-kéfir después del 96 th día de incubación, con los nuevos granos logrando una morfología de kéfir idéntica hasta 120 días, y presentando una media diámetro de 22 ± 2 mm. Estos hallazgos indican un cuidado parcial de las caracteristicas estructurales y probióticas del kéfir a lo largo de el avance del grano inducido de manera no natural, un prominente nivel de autoorganización para el cultivo simbiótico. En este propósito también probamos el potencial de los granos de kéfir para contener una cepa exógena, intentando de integrar Saccharomyces cerevisae en el avance del grano. El trámite, semejante al descrito antes [ 21 ], se realizó por medio de la adición de diferentes proporciones S. cerevisae en los cultivos iniciadores antes de la conformación de las cuentas de alginato-kéfir.
La actividad antiinflamatoria de estos granos editados, según lo revelado por los ensayos de edema de la pata en ratas, mostró inclusive más grande que los granos originarios ( Figura 6) . Este desarrollo artificial de internalización de la cepa para los granos de kéfir recomienda un plan elogiable para integrar algunas bacterias con objetivos específicos, entre otras cosas, Lactobacillus acidophilus para achicar el colesterol en la sangre. Así, estudios previos [ 6 ] demostraron escenarios disminuidos en el colesterol total en suero de ratas alimentadas con una dieta alta en colesterol suplementada con leche fermentada producida por granos de kéfir editados. Este kéfir modificado se consiguió de una mezcla de 10 tipos de Lactobacillus y S. cerevisae . Además, la adición de células de levadura de S. cerevisae de un cocultivo de L. kefiranofaciens y C. kefyr , o T. delbrueckii , no mostró ningún efecto mejorado sobre la producción de kefiran [ 22 ]. Sin embargo, cuando se agregaron extractos de levadura a cultivos de L. kefiranofaciens , los autores detallaron un incremento en la producción de kefiran y sugirieron el papel de los extractos de levadura como imitadores de las acciones de las células de levadura en L. kefiranofaciens [ 19459063] en los granos como un sistema de cocultivo típicamente natural.
Figura 6.
Inhibición del edema de la pata de rata inducida por carragenano (1 mg / pata, 0,1 ml) por medio de suspensiones de kéfir obtenido del cultivo de granos de kéfir originarios, y los producidos por simbiogénesis con o sin incorporación de S. cerevisae. Los ensayos se realizaron a lo largo de 30 y 60 días después de conseguir los granos editados. Control positivo – 10 mg kg-1 de indometacina [20].
Esta propiedad de la modulación inseparable de cepas de kéfir también se informó con granos originarios, siempre que se almacenaron a lo largo de largos períodos, o inclusive a lo largo de su cultivo [ 23 ] . En este propósito, hemos evaluado la actividad bacteriocinina del kéfir desde un potencial de desarrollo adaptativo contra algunas cepas patógenas [ 24 ]. Para conseguir esto, las muestras de kéfir se expusieron con Staphylococcus aureus o Escherichia coli , pipeteando 1 ml de 2×10 9 células / ml de las cepas en 70 ml de cultivo de kéfir en cada 48 h-cambio medio (50 g L -1 melaza) a lo largo de 20 días. Los granos de kéfir se separaron, se secaron y se pesaron antes de que cambiara el medio. Después, se extrajeron 0,1 ml del sobrenadante del kéfir fermentado y se sembraron en agar EMB ( E. coli ) o agar manitol ( S. aureus , después de la incubación a 35,5 ° C a lo largo de 48ºC). h. También se usó la misma alícuota para los ensayos antimicrobianos de difusión en disco. Después, se centrifugaron 0,3 ml de kéfir inoculado, se filtró con un filtro Millipore de 0,22 mm y se pipeteó en medio BHI que contenía 3,3 ml de cada bacteria inoculada (escala unitaria de Mc Farland) La incubación se realizó a 35,5 ° C hasta 12 h, y el desarrollo bacteriano se controló espectrofotométricamente a 600 nm. Después del período de incubación, los granos enseñaron cambios morfológicos destacables en su composición para los grupos tratados con las inoculaciones. exhibe de kéfir filtrada S. aureus – estimulada incubada a lo largo de 20 días fue con la capacidad de suprimir el desarrollo de las mismas cepas de S. aureus ( Figura 7) . La indicación recomienda un potencial epigenético o adaptativo para que la secreción de bacteriocininas por el kéfir resista a S. aureus , dado que la suspensión agria se cambió a intervalos de 48 h, evadiendo la existencia de moléculas antibióticas antes producidas por el simbiótico.
Figura 7.
Cambios en el desarrollo de S. aureus en presencia de suspensiones de kéfir estimuladas a lo largo de 20 días con S. aureus o E. coli [24].
2.2. Caracteristicas del kéfir
2.2.1. Suspensión, granos y kefiran
2.2.1.1. Kefiran acuoso (AK)
Existen varios estudios relacionados con las caracteristicas saludables alegadas del consorcio de kéfir, pero primordialmente con preparaciones lácteas. Consecuentemente, se conoce que el kéfir lechoso muestra un extenso espectro antibacteriano, optimización gastrointestinal y proliferación de la flora intestinal láctica habitual y colonización bacteriana, anticancerígeno, cicatrización de lesiones y ocupaciones de β -galactosidasa, inmunoestimulante, anti- diabetes [ 25 ], antioxidante [ 26 ], anti-lipidémico [ 27 ], y efectos antialérgicos, etc [ 28 ]. Del mismo modo, aunque hay varios datos reportados sobre un exopolisacárido con caracteristicas prebióticas recluidas de los granos de kéfir, la literatura solo tiene relación a la molécula purificada de fuentes lácteas. En este propósito, nuestro grupo de investigación había estudiado las caracteristicas físico-químicas y prebióticas de una variación del kefiran lechoso, un oligosacárido llamado kefiran acuoso (AK), y fraccionado de la solución de melaza [ 29 ]. Las resoluciones AK recluidas preparadas al 0.1% habían anunciado un desempeño medio, viscosidad intrínseca, consistencia relativa y conductividad eléctrica de, respectivamente, 1.1 g kg -1 de granos secos, 0.297 ± 0.03 dL g – 1 , 1,044 g mL -1 , y 2,46 μ S cm -1 . La espectroscopía infrarroja (IR) de AK presentó bandas fuertes a 3600-3100 ( ν OH) y 10 7 cm -1 ( ν [ 19459063] CO), lo que recomienda una naturaleza polihidroxilada de la exhibe. Se presentaron bandas inferiores en 2950-2880 ( ν CH), 1470 y 1390 cm -1 ( δ x CH), revelando una característica alifática del compuesto . La composición de los residuos de monosacáridos de AK, según lo preciso por cromatografía de cubierta fina y GC, presentó valores medios de glucosa (40%), ramnosa (24%), galactosa (10%) y arabinosa (26%). Desde las mediciones de HPLC, se determinó el peso molecular de AK como 3534 Proporciona, lo que recomienda una composición de oligosacárido de diez monómeros para el prebiótico. El kefiran de agua extraña vez se comunica en la literatura relacionada, así como en los bancos depositarios de patentes [ 30 ]. No obstante, tanto el kéfir como el kefiran, primordialmente a partir de leche, se han usado para conseguir productos biotecnológicos factibles técnica y comercialmente, como cultivos iniciadores por inmovilización de caseína en la producción de queso [ 31 ], aditivo de geles lácteos de nivel alimenticio para productos fermentados [ 10 ], escala industrial de fermentación alcohólica de suero [ 32 ], para fermentación alcohólica por lotes [ 34 ], para la explotación de residuos de la industria de los cítricos [ 33 ], y para el avance de películas comestibles multipropósito [ 35 ], etc.
2.3. En superficies biológicas
2.3.1. Membranas biomiméticas
Aunque kefiran ha anunciado distintas ocupaciones prebióticas, todavía no se ha comprendido ningún mecanismo directo de su acción sobre las membranas celulares. Con el propósito de contribuir a esto, se estudió la predominación de AK en las membranas biomiméticas compuestas de l- α -fosfatidilcolina / membrana lipídica bicapa soportada por colesterol por medio de voltamperometría y espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) [ 4 ] Nuestros hallazgos proponen que kefiran podría inducir poros moleculares en superficies de membrana ipid de bicapa soportada (s-BLM) hasta 5 minutos a 11.4 μ mol L -1 , y con 34 Å de radio inicial. El mecanismo sugerido ( Figura 8) se ve involucrar algunos links de hidrógeno entre el carbohidrato y el grupo de fosfato de la cabeza del fosfolípido con un modelo de interacción tipo alfombra, y está relacionado con la concentración prebiótica. Estos resultados tienen la posibilidad de ayudar a revelar relaciones moleculares directas entre oligosacáridos prebióticos y superficies celulares, los dos relacionados con la actividad biológica del compuesto prebiótico en numerosos modelos experimentales. Así, la actividad prebiótica de AK también podría estar relacionada con algunas vías metabólicas, como los sistemas de cinética enzimática o de transporte. Pensando en ello, hemos evaluado la acción elogiable de AK en suspensiones mitocondriales, como modelo de un sistema metabólico terminado e sin dependencia.
Figura 8.
Mecanismo tipo alfombra propuesto para la interacción kefiran-membrana de agua. Las moléculas de oligosacáridos se alinean en la área de la membrana (a) hasta que se consigue una concentración crítica (b) y se produce un efecto semejante al detergente (c). En esta etapa, los oligosacáridos de kefiran y los elementos de la membrana forman agregados que van de la membrana y causan modificaciones (d) [4].
2.3.2. Mitocondrias
Se investigaron los mecanismos de acción celular para comprobar la actividad potencial del agua kefiran en la actividad respiratoria de las mitocondrias recluidas [ 36 ]. Las muestras de hígado de rata (1200 mg mL -1 proteína) se preincubaron con kefiran en tampón fosfato 20 mM pH 7.3 que contenía sacarosa 70 mM, EDTA 1 mM y MgCl 5 mM 2 . El consumo de oxígeno de las mitocondrias se determinó por cronoamperometría a suspensiones de agitación de 50 rpm en 2 ml usando un electrodo tipo Clark Pt-Ag / AgCl conectado a un potenciostato, y con -600 mV de potencial aplicado. El sistema se calibró antes con una solución saturada de N 2 y suspensiones de levadura de panadería. Las señales recientes después de adiciones consecutivas de tampón, muestras mitocondriales, succinato 100 mM, 100 μ L de kefiran y ácido malónico 100 mM, se consiguieron a lo largo de 90 minutos. Después del filtrado digital correcto y la amplificación de la señal, los valores recientes obtenidos se convirtieron en concentración y fluído de oxígeno. Los resultados de las suspensiones de orgánulos mostraron una inhibición total de la respiración mitocondrial con una solución de kefiran al 0,2%. Con el propósito de considerar las caracteristicas prebióticas de AK en las vías respiratorias mitocondriales (Complejo I y II), las suspensiones de mitocondrias (300 mg mL -1 proteína) se preincubaron con el prebiótico adjuntado con diferentes fuentes de carbono (Glu 50 mM , Malato 100 mM, piruvato 50 mM o succinato 100 mM) [ 37 ]. Después de las incubaciones, se encontró una disminución en los valores de absorbancia a 340 nm después de la adición de NADH 2 mM. Además, también se hallaron algunos cambios a 520 nm, después de la adición de ferrycianida de potasio 5 mM en solución de KCN 50 mM, usando ácido malónico (100 mM) y metformina (1 mM) como marcadores inhibidores para el Complejo I y II, respectivamente. La inhibición del Complejo I mostró valores de 53 ± 4% para kefiran (50 mg mL -1 ), en tanto que el Complejo II mostró valores de inhibición de 54 ± 5% para AK. Además, una prueba de hinchazón mitocondrial también reveló un valor medio incrementado del 13% para el kefiran probado. Estos resultados en su grupo señalan a un efecto inhibidor de la AK en la cadena de fosforilación oxidativa de las mitocondrias.
2.4. Sobre microorganismos
El kéfir es bien popular por soportar a un extenso espectro de cepas patológicas, y se ve ser reconocido como seguro, más allá de que se informó que la contaminación de su cultivo es una fuente de inconvenientes de salud. [ 38 ]. La actividad antibiótica de kéfir y AK purificada (50 mg ml -1 ) se ha evaluado [ 8 ] usando tanto el método de difusión en disco como las pruebas de susceptibilidad contra algunas bacterias patógenas bien conocidas ([ 19459062] S. pyogenes , S. salivariu s, S. aureus , P. aeruginosa , S. tiphymurium , E. coli , L. monocytogenes y C. albicans ). Los resultados de la difusión del disco promovida por kefiran están presentes en Figura 9 . A rapid decrease in surviving pathogens with 0.45 mg mL -1 of kefiran in the susceptibility tests was also observed, whereas the prebiotic was able to produce inhibition haloes about 26±2 mm, greater than those found for oxacilin, ampicillin, ceftriaxone, and azithromycin, at their usual concentrations. In these assays, S. pyogenes and S. tiphymurium were the most sensible bacteria challenged with kefir in vitro [ 39 ], as both strains had their growth completely abolished into Petri dishes, as revealed by CFU counting after 24 h of selective cultivation. Listeria monocytogenes also presents a valuable target for testing kefir, due to its commonly contamination in dairy products (milk and home made cheese), and its strong resistance at higher temperatures and osmolarity, together with the survival of strains at low pH medium. In this way, we evaluated MIC and MBC values for kefir suspension (0.1, 1.0 and 1.5 mL) pipetting the aliquots together with 0.1 mL L. monocytogenes (3 x 10 8 cell/mL), and following incubation at 35.5 °C for 24 h. After inoculation for 24/48 h, it was found a bacteriostatic property of kefir at 24 h with all aliquots, but a bacteriocidal activity at 48 h with 1.5 mL kefir suspension, suggesting a relative protection of kefir and their prebiotic compounds against Listeria monocytogenes . In another work, we tried out antimicrobial activity for both water kefir and its grain extract against Staphylococcus aureus [ 40 ]. Kefir samples were thawed and continuously cultivated in 100 g L -1 of molasses solutions during 7 days and 24 h of nourish replacement. The grain extract was obtained from 250 g of kefir grains grinded, boiled in distilled water during 1 h and precipitated twice with cold ethanol for 18 h. Antimicrobial activity was carried out against Staphylococcus aureus ATCC 6538 through the agar difusion method using paper discs. Suspensions of 0.1 mL of S. aureus were innoculated into 25 mL BHI medium and swabbed in Petri dishes. Paper discs containing 0.1 mL of 5, 20 and 50 mg of kefir extract, 0.1 mL of kefir suspension, 0.9% NaCl (negative control), and ampicillin (10 μ g, positive control) were transferred to growth dishes following incubation at 35 °C for 24 h. The antimicrobial activity of kefiran extract against S. aureus attained semejante values for disc haloes with 50 mg/0.1 mL (20±1 and 27±3 mm), and closer to the ampicillin halo (21±0 mm). Although the polysaccharide extracted from kefir grains presented a lower inhibition area for S. aureus as compared to ampicillin, the latter drug is known to exhibit some adverse effects such as diarrhoea, sickness, vomit and kidney disorders.
Figure 9.
Zone diammeters obtained by disc diffusion of haloes produced from the action of water kefiran against some pathogenic strains.
2.5. On animals
Despite the known probiotic and prebiotic effects of kefir and AK, little is reported about their responses in healthy individuals, e.g. a physiological status of animals naturally receiving fermented kefir suspensions [ 41 ]. Targeting this, it was evaluated the consumption of kefir suspension byWistar rats (n=5/group) kept in metabolic cages at room temperature, and with water and commercial diet ad libitum [ 42 ]. After 30 days no mean difference was observed between the animals receiving daily 1 mL of kefir suspension (50 g L -1 24 h-fermented) by gavage, and the control group (1 mL NaCl 0.9 %). However, the kefir group of male rats excreted more urine (29±14 %), consumed more ration (22±6 %) and water (18±7), and get more weight (43±16 %) than the female group of kefir.
2.5.1. Anti-inflammatory and antimicrobial activity
2.5.1.1. Rodents
Anti-inflammatory responses of sugary kefir and its derivatives are poorly related in the literature. Notwithstanding, kefir may exert a beneficial effect on acute inflammatory responses, additonally improving the immune status of treated animals. In this sense an ED 50 value of 12.5 mg kg -1 was found by rat paw edema, together with inhibitions values about 30±4 % and 54±8 %, for carrageenan ( Figure 10) and dextran-induced inflammatory process, respectively (n=8/group). However, no changes in vascular permeability was evidenced in that experiments [ 29 ]. When compairing with cyproheptadine, a H1-receptor blocker, these results pointed to the antiinflammatory response probably derived from serotonin receptor and arachidonic acid pathways. In another assay, the anti-edematogenic activity of both kefir suspensions and grinded grains were also evaluated with a semejante approach through carrageenan, dextran or histamine. Kefir suspensions orally administered 30 min before stimulli were found to be more effective (62 % inhibition) than kefir grains mechanically disintegrated (40 %). The overall data suggest a participation of prostaglandins mediators more than just histamine and serotonine in the anti-inflammatory response as a whole.
Figure 10.
Anti-inflammatory activity of kefir (suspension and extract) and water kefir carbohydrate (AK) on the rat paw edema induced by intraplantar injection of carrageenan (1 μg mL-1, 1 mL). Positive control – indomethacin, 10 mg kg-1 [9, 29].
With the use of an analgesia model of acetic acid-induced writhing reflex in mice [ 43 ], both kefir grains and their soured suspensions also exhibited an anti-inflammatory response through abdominal contorsions (28±2 % inhibition, n=5/group), whenever the animals were treated i.p. with 0.6 % acetic acid ( Figure 11) .
Figure 11.
Oral administration of 24h-fermented kefir suspension (1 mL) and indomethacin (10 mg kg-1) on the acetic acid-induced writhing reflex in mice, as induced by 0.6% acetic acid [43].
Following this findings, cicatrizing activities of both kefir and purified kefiran (50 mg mL – 1 ) were also conducted with rats (n=5/group) [ 8 ]. For this test, a 6 mm-punched wound was made on a shaved dorsal area of the animals, following inoculation of Staphylococcus aureus at 3 x10 8 cels/mL, and treatment of the animals topically with a 70 % kefir gel made with kefiran up to 7 days. The treatment resulted in a faster reduction of the infected-induced wound diameter, as compared with the control group ( Figure 12) , and even greater than the group treated with a neomycin-clostebol association at day 7.
Figure 12.
Cicatrizing activity in skin lesions of animals inoculated with 3×108 CFU/mL of S. aureus. Data represent untreated animals, animals treated with 5 mg kg-1 of neomycin-clostebol association (positive control), and animals treated with 70% kefir gel [8].
The skin samples excised from the animals treated with kefir gel also presented a well developed granulation of the epithelium together with neovascularization areas, suggesting a partial healing in the treated group ( Figure 13) [ 8 ].
Figure 13.
Morphological changes of the skin lesions induced in rats treated with kefir gel 7 days after the abrasions. Haematoxylineosin, 200X. (a) Control rats untreated; (b) rats treated with 5 mg/kg of neomycinclostebol emulsion; (c) rats treated with 70% kefir gel [8].
A kefir gel prepared as above was also tested with a prior heat treatment of kefir, aiming do distinguish between probiotic and prebiotic effects of the consortium. In that job, an oitment developed from grinded grains at 70 % was topically used in cicatrizing assays, for testing their microbial resistance against different heat treatments [ 24 ]. Cream samples were elaborated with prior treatment of kefir grains by autoclaving (15, 30, and 45 min), or by heating in a water bath at 55 °C, for 15 h. The kefir creams were then applied topically to a 8-mm wonded-induced dorsal area of rats (n=25/group), previously inoculated with P. mirabilis , following cicatrizing measurements up to 7 days. The positive control group was treated with a cream made from a chloramphenicol-colagenase association. IL-1 β , TNF- α , and cell blood countings were also determined at the end of the treatments. The main results can be shown at Figure 14 . The kefir cream previously treated at 55 °C for 18 h exhibited a semejante decrease in dorsal lesion areas as the positive group (chloramphenicol-colagenase association), and even that observed with the untreated kefir group at the 5 th and 7 th days.
Figure 14.
Relative histological findings (MN, PM, epithelization and granulation tissue) from rats infected with P. mirabilis, and treated with different preparations of kefir ointments. MN and PM are, respectively, a relative counting for mononuclear and polymorphonuclear cell. The ointments were prepared with native kefir grains, as well with thermized (60 °C, 15 h) and autoclaved grains. Positive control – collagenase-chloramphenicol association [24].
Intriguing, the group treated with autoclaved kefir grains also revealed a meaning decrease of lesion areas, greater than that presented for the negative control group (NaCl 0.9 %).
These findings happened to be so due to a nonproteic molecule taking part in the healing action to the animals, in agreement with the activities of the isolated AK molecule. Furthermore, all tested groups were able to enhance the epithelial tissue proliferation, as compared with the negative control group. In another inflammation model, anti-granuloma assays were also conducted with sugary and milk kefir, together with grinded grains (kefiran extract) and isolated AK. To do this, rats (n=5/group) were challenged with induction of granulomatous tissue by subcutaneously introduction of cotton pellets through abdominal skin incisions, following oral treatment with the agents after 2 h during 7 days [ 7 ] ( Figure 15) .
Figure 15.
Effect of administration of kefir suspensions in soured milk and molasses (50 g L-1), or aqueous polysaccharide extract (PE, 0.1 %, 1 mL), during 6 days, on the formation of granulomatous tissue in rats. Positive control – dexamethasone (0.2 mg kg-1) [7].
Both aqueous and milky kefir suspensions (50 g L -1 ) showed semejante inhibition values (41±3 and 44±6 %, respectively), whereas the isolated kefiran from molasses suspension lead to a smaller inhibition (34±2 %). As kefir grains is known to stimulate innate immune responses against pathogens [ 8 ], we had evaluated the immune activity of neutrophils from rats treated with water kefir suspension [ 44 ]. Then cytokine TNF- α levels, cell recruiting, cellular metabolism, neutrophils oxygen uptake, H 2 O 2 production, and myeloperoxidase screening, were tested in animals treated with kefir by gavage. ( Figure 16) . Wistar rats receiving kefir suspension p.o. during 7 days revealed meaning differences as compared as those receiving NaCl 0.9 %. In that animals there were a decrease of 30±3 % in neutrophil recruiting from collected peritoneal cells, 32±3 % in peroxyde production stimulated by forbol ester, and 26±1 % in the myeloperoxidase activity. Then, the orally administered suspensions of water kefir was able to decrease general neutrophil activity in treated animals, probably following antioxidative pathways of the metabolism ( Figure 17) .
Figure 16.
Relative values for neutrophil recruiting, myeloperoxidase index (MPox), oxygen consumption, and H2O2 production from peritoneal cells isolated from rats treated p.o with water kefir suspensions, and during 7 days after stimuli. H2O2 release was stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Positive controls – α-tocopherol (H2O2 and MPox assays), dexamethasone (cell recruiting) [44].
Figure 17.
Mapping of cellular and biochemical events evaluated from rat neutrophils treated with water kefir. (Dotted arrows indicates reasonable mechanisms for kefir action). (1) Cellular recruiting; (2) Cellular respirometry; (3) Cellular metabolism; (4) Production of H2O2; (5) Identification of the MPO. Hexose monophosphate (HMP); Myeloperoxidase (MPO) [44].
2.5.1.2. Intestinal motility
Animal digestibility in rats has been also attempted with kefir samples [ 45 ]. In that work it was evaluated changes in intestinal motility induced by a sugary kefir suspension daily administered (n=6/group, Wistar rats) during 15 days. After this period, the animals were kept without food during 24 h and treated with water kefir suspension, water, atropine (negative group), or acetylcholine (positive group). Following, the animals received orally 10 % active charcoal after 30 min. The animals were then submitted to euthanasia after 45 min and the intestinal tracts were exposed from the pylorus to cecum. As a result, kefir suspension was able to enhance intestinal transit up to 65±2 % ( Figure 18) , closer to the acetylcholine group, and greater than the negative groups. These results indicated an improvement of the peristaltic activity of the intestinal tract of the rats treated with kefir, and evoke its elogiable use on treating bowel diseases and gut problems.
Figure 18.
Action of kefir suspension (8.6 g kg-1), atropine (1 mg kg-1), acetylcholine (1 mg kg-1, positive control), and NaCl (0.9 %), orally administered, on the intestinal motility of Wistar rats, as determined by charcoal administration.
2.5.1.3. Dogs
Based on the promising findings obtained with rodents, we had inspect some in vivo responses of clinically healthy dogs and rabbits treated orally with kefir suspensions. Dogs presenting balanoposthitis (n=5/group), a commom inflammation of the foreskin surfaces of the genital tract of domestic animals, were treated with a 70 % kefir lanette-based ointment, applied daily during 3 days, whereas the positive group was treated with a 0.2 % nitrofurazone solution [ 46 ]. After the 25 th day, there were more remitted symptoms in the animals treated with kefir cream (62.5 %), as compared as those treated with nitrofurazone solution (37.5 %), a largely compound used in gynaecological infections ( Figure 19) . Furthermore, the action of the kefir ointment showed more selective for Staphylococcus than nitrofurazone, as it was able to decrease 57 % in the frequency of that strains, albeit preserving the naturally-occurring microorganisms of that animals.
Figure 19.
Bacterial counting before and after the treatment of balanoposthitis in dogs with nitrofurazone or kefir gel. Positive control – 0.2% nitrofurazone [46].
2.5.1.4. Lipidemic activity
The intake of soured kefir was tested in the healthy rabbits to identify its elogiable effects in serum cholesterol levels. Rabbits (n=10/group) were fed with kefir grains in natura mixed with reconstituted pelletized industrial rations during 30 days, following their growth and serum lipid assessments (total cholesterol, triglycerides, HDL, LDL, and VLDL) [ 47 ]. The rabbits who received kefir grains in natura had significantly lesser growth than the control group. Besides, the fraction of total cholesterol and HDL had significant increases, with a mean reduction of the Castelli II index (LDL/HDL ratio) for the kefir group. This datum suggest the increase of total cholesterol as due to the increase of serum HDL, as measured from the rabbit auricular veins. As reported before [ 27 ] the total cholesterol levels has been reduced in broiler chicks fed with milk-fermented kefir, in agreement with above findings. In conclusion, these results would suggest that the probiotic can be thought for weight control therapies and prophylactic actions against dyslipidemies.
2.6. On plant
The addition of diverse compounds to plant culture medium has been successfully used for different species in tissue culture techniques. Banana and malt extract, as well as coconut water, e.g., is related to promote the growth of different species of orchids in micropropagation studies [ 48 ]. Although the action of kefir in plant physiology is unknown, recent studies demonstrated that kefir was able to induce the synthesis of phytoalexins in soy cotyledons, and also inhibits germination in uredioniospores of Phakopsora pachyrhizi , a fungus which cause Asian rust [ 49 ]. In this goal, the in vitro growth and foliar anatomy of orchids kept in a culture medium with different concentrations of Knudson medium, kefir and sucrose have been evaluated [ 50 ]. Biochemical analysis (carotenoids, soluble sugars, chlorophyll, phenolic compounds, and key enzymes of secondary metabolism), foliar anatomy and in vitro growth of orchids ( Cattleya walkeriana ) cultivated at different concentrations of Knudson medium, kefir and sucrose, were valued through micropropagation studies. [ 51 ].
Figure 20.
Foliar anatomy of micropropagated orchids (Cattleya walkeriana) cultivated in vitro with Knudson medium (A), and 25 % Knudson medium and 75 % kefir grains (B). Vascular system (sv), foliar mesophile (mf), epidermis (ep) and cell disorders (dc) [50].
Furthermore, the biochemical data assessed from the micropropagated orchids ( Figure 21) evidenced a meaningful increase of the carotene level (up to 24 times greater than control), total phenolic (33 %) and polyphenol oxidase activity (about 3 times greater than control). In this sense, the use of kefir in in vitro orchid micropropagation have been promoted more growth, organization and thickness of foliar tissues.
Figure 21.
Changes in some compounds and secondary metabolism-key enzymes of micropropagated orchids cultivated with 75 % grinded kefir grains in Knudson medium [51].
The resulted treatment of micropropagated orchids ( Figure 20) has been displayed a better organization and larger thickness of the mesophile as observed in culture media at 75 % kefir, when compared with the anatomical development of plants cultivated exclusively in Knudson medium [ 50 ].
3. Conclusion
Kefir can be considered an amazing example of coevolution of a microbial consortium. Their grains seems to simulate a multicellular living organism, as they are able to growth, divide, and age. From a survival point of view, kefir is very well adapted to resist to different and even extreme environments, also competing to a large spectrum of microbial strains. As kefir have acquired a strong resistance against several microorganisms, as well to improve the natural immunity of mammals since ancient ages, it is reasonable to think the consortium as a potential naturally-occurring drug able to decrease a large sort of illness afflictions.
Acknowledgement
The author gratefully acknowledge to all the students that have participated on the kefir studies summarized in this work, as well as the following Brazilian research support institutions, Minas Gerais State Research Foundation – FAPEMIG and National Council for Scientific and Technological Development – CNPq.